ORDIN nr. 475 din 5 decembrie 2001

1. Toate probele de furaje supuse controlului oficial și pentru care exista interdicția de a conține constituenti de origine animala vor fi controlate obligatoriu și prin examen miscroscopic.

2. Fixarea liniilor directoare prevăzute în cap. II, precum și respectarea procedurilor de examinare microscopica nu exclud folosirea și a altor metode de analiza, care vor fi validate științific și aprobate de autoritatea sanitară veterinara competența, pentru identificarea și/sau estimarea constituentilor de origine animala.

3. În cazul depistarii de probe cu rezultate pozitive în urma utilizării metodei microscopice, probele respective vor fi analizate obligatoriu și prin alte metode mai performanțe (inclusiv identificarea speciei), în vederea clarificarii situației.

4. Furajele în care au fost depistati constituenti de origine animala vor putea fi folosite în hrana altor specii la care nu exista interdicție pentru astfel de componente.

5. Institutul de igiena și sănătate publică veterinara va lua măsuri de instruire a personalului propriu, a celui din laboratoarele sanitare veterinare de stat județene, în vederea implementarii acestor prevederi.

6. Orice rezultat pozitiv apărut în urma folosirii acestei metode va fi anuntat imediat Institutului de igiena și sănătate publică veterinara și Agenției Naționale Sanitare Veterinare.

1. Obiect și domeniu de aplicare

Acest ghid se va utiliza acolo unde detectarea constituentilor de origine animala (definiți ca produse de la procesarea carcaselor sau părților acestora de la mamifere, păsări sau pești) din furaje se efectuează prin examen microscopic.

În cazul în care se cere și o apreciere cantitativă a acestor constituenti, se vor urma instrucțiunile prevăzute la pct. 7.

2. Sensibilitate

În funcție de natura constituentilor (< 0,1%).

3. Principiu

O proba reprezentativa, luată în acord cu prevederile impuse de Ordinul ministrului agriculturii, alimentației și pădurilor nr. 390 din 15 octombrie 2001, va fi folosită după pregătire pentru identificare. Constituentii de origine animala sunt identificati pe baza caracterelor microscopice tipice (de exemplu: fibre musculare, părți de oase sau cartilaje, fire de par, sânge, coaja de ou, oase de peste etc.). Identificarea se va face atât din filtrat (pct. 6.1), cat și din sedimentul concentrat (pct. 6.2) al probei.

4. Reactivi*):

──────────

4.1. agenți de clarificare:

4.1.1. cloral hidrat (soluție apoasa 60% v/v);

4.1.2. ulei de parafina;

4.2. agenți de concentrare:

4.2.1. tetracloretan (densitate 1,62);

4.3. agenți de colorare:

4.3.1. reactiv Bradford;

4.3.2. soluție iod/iodura de potasiu;

4.3.3. reactiv Millon;

4.3.4. reactiv pentru cistina (2 g acetat de plumb și 10 g NaOH/100 ml H(2)O).

Reactivii listati pot fi înlocuiți cu reactivi care dau rezultate asemănătoare.

5. Echipament și accesorii:

5.1. balanța analitica (d=0,001 g);

5.2. dispozitiv de maruntire, macinare;

5.3. site cu ochiuri de 0,1-2 mm;

5.4. stereomicroscop cu magnificatie > 50';

5.5. microscop compus (magnificatie > 400') cu lumina polarizata;

5.6. sticlarie de laborator.

6. Procedura

În funcție de natura materialului (dacă este necesar, se marunteste), se iau cel puțin 10 g de proba și se divid în doua părți, una de cel puțin 5 g pentru partea filtrata (pct. 6.1) și una de cel puțin 2 g pentru sedimentul concentrat (pct. 6.2). Colorarea cu agenți de colorare (pct. 6.3) este recomandată pentru identificare.

6.1. Identificarea constituentilor de natura animala în filtrat

O cantitate de minimum 5 g din proba este trecută prin site (pct. 5.3) în cel puțin două fractii.

Fractia (fractiile) > 0,5 mm (sau o parte reprezentativa din fractie) se întinde în strat subtire pe un suport adecvat și se cauta componentii de origine animala la stereomicroscopul (pct. 5.4) cu diferite puteri de marire.

În stratul (straturile) < 0,5 mm se cauta componentii de origine animala la microscopul compus (pct. 5.5) cu obiective diferite.

6.2. Identificarea constituentilor din sediment concentrat

Se iau cel puțin 2 g (cantarite cu o precizie de 0,001 g) din proba, se introduc într-un flacon sau într-o palnie de separare și se adauga 15 ml de tetracloretan (pct. 4.2.1). După omogenizare se agita conținutul de mai multe ori și apoi se lasă în repaus (cel puțin 1' și nu mai mult de 2-3') pentru depunerea sedimentului.

Se decanteaza supernatantul și sedimentul este uscat la etuva și cantarit repetat până la masa constanta (± 0,001 g). Cantarirea este necesară numai în cazul în care se face o apreciere cantitativă. Sedimentul se examinează în întregime sau în cota-parte pentru fragmente de oase, la stereomicroscop (pct. 5.4) și la microscop (pct. 5.5).

6.3. Utilizarea agenților de clarificare și de colorare

Identificarea microscopica a constituentilor de origine animala se poate face prin utilizarea agenților speciali de clarificare și colorare:

● cloral hidrat (pct. 4.1.1) - prin încălzire ușoară structura celulara poate fi mult mai clara datorită gelatinizarii granulelor de amidon și indepartarii particulelor nedorite;

● ulei de parafina (pct. 4.1.2) - componentele oaselor pot fi identificate datorită faptului ca majoritatea porilor rămân umpluti cu aer și apar ca spații negre cu diametrul de ~ 5-15 æm;

● reactivul Bradford (pct. 4.3.1) - este utilizat pentru detectarea proteinelor (culoare specifică albastra). Se dilueaza cu apa 1:4;

● soluția de iod/iodura de potasiu (pct. 4.3.2) - este utilizata pentru identificarea amidonului (culoare albastra-violeta) și a proteinelor (culoare galben-portocalie). Se dilueaza dacă este necesar;

● reactivul Millon (pct. 4.3.3) - prin încălzire ușoară componentele osoase capata o culoare roz;

● reactivul pentru cistina (pct. 4.3.4) - prin încălzire ușoară constituentii care conțin cistina (par, fanere etc.) capata o culoare neagra-maronie.

7. Calcul și evaluare

În cazul în care estimarea cantitativă este necesară, se va proceda conform acestui punct.

Calculul poate fi făcut doar dacă constituentii conțin fragmente de oase. Fragmentele de oase de la animale terestre homeoterme (mamifere și păsări) pot fi deosebite de oasele de peste prin examen microscopic, pe baza vizualizarii lacunelor tipice. Proporția de constituenti de origine animala se poate calcula ținând seama de:

- proporția estimată (masa, în %) de fragmente osoase din sediment; și

- proporția (masa, în %) de oase în constituentii de origine animala.

Estimarea se face pe baza a cel puțin 3 (dacă este posibil) până la 5 câmpuri pentru un strat. În nutreturile combinate, de regula, sedimentul nu conține numai fragmente de oase, ci și alte componente cu greutate specifică mare, de exemplu: minerale, nisip, fragmente vegetale lignificate.

7.1. Calculul procentual al fragmentelor de oase:

în care:

S = masa sedimentului (mg); c = factor de corectie (%) pentru estimarea procentului de oase animale în sediment; d = factor de corectie (%) pentru estimarea procentului de oase de peste și solzi în sediment; W = masa probei prelucrate pentru sedimentare (mg).

7.2. Estimarea valorii pentru constituenti de origine animala

Proporția de oase în produsele animale este variabila. În cazul fainii de oase procentul este de 50-60%, iar în cazul fainii de carne, de 20-30%; la făina de peste procentul de oase și solzi este variabil în funcție de specie, în general de 10-20%.

Dacă se cunoaște specia de la care provine produsul, se poate calcula conținutul estimat.

Conținutul estimat de constituenti de la animale terestre (%) =

în care:

S = masa sedimentului (mg); c = factor de corectie (%) pentru estimarea procentului de oase animale în sediment; d = factor de corectie (%) pentru estimarea procentului de oase de peste și solzi în sediment; f = factorul de corectie pentru proporția de oase din constituentii de origine animala din proba; W = masa probei prelucrate pentru sedimentare (mg).

8. Exprimarea rezultatelor

Pot exista următoarele situații:

8.1. la capacitatea de identificare la microscop nu exista constituenti de origine animala (asa cum sunt definiți la pct. 1) în proba analizata;

8.2. la capacitatea de identificare la microscop exista constituenti de origine animala *) în proba analizata.

În acest caz raportul examinării poate fi specificat astfel:

8.2.1. la capacitatea de identificare la microscop exista cantități mici de constituenti de origine animala *) în proba analizata;

──────────────

8.2.2. în funcție de experienta analistului:

- exista constituenti de origine animala. Conținutul de fragmente de oase (peste/animale terestre);

- în cazul fragmentelor de oase de la animale terestre, eventual specificat de la păsări sau mamifere (vezi pct. 9.3), este estimat un ordin de marire de ......... %, egal cu ..........% constituenti animali, când se calculează în baza a ............ % oase în constituenti animali, utilizându-se factorul de corectie f; sau

- au fost gasiti constituenti de origine animala în cantități masurabile.

Pentru situațiile prevăzute la pct. 8.2, 8.2.1 și 8.2.2, când oasele animalelor terestre au fost identificate, raportul trebuie să conțină date suplimentare. Posibilitatea ca următorii constituenti să fie derivati de la mamifere nu poate fi exclusa.

Aceasta clauza nu este necesară dacă fragmentele de oase de la animale terestre au fost identificate ca aparținând pasarilor sau mamiferelor (vezi pct. 9.3).

9. Recomandări

9.1. Se recomanda ca în cazul constituentilor voluminosi și în cantitate mare sedimentul obținut la filtrare să fie împărțit în doua fractii (de exemplu, utilizarea unei site cu ochiuri de 320 æm). Fracțiunea cu constituenti voluminosi poate fi examinata ca preparat cu ulei de parafina, iar fracțiunea cu particule fine trebuie examinata la microscop.

9.2. Sedimentul concentrat (pct. 6.2), dacă este necesar, poate fi divizat mai departe utilizându-se un agent de concentrare cu densitate mai mare.

9.3. În funcție de experienta analistului identificarea originii poate fi facuta utilizându-se un preparat specific histologic prin care poate fi facuta aceasta identificare.

────────────────