Capitolul 1 — Introducere, obiective și definiții ↑ Cuprins
1. Prezentul manual de proceduri de diagnostic cuprinde metode de prelevare de probe și criterii pentru evaluarea rezultatelor testelor de laborator pentru confirmarea și diagnosticul diferential al bolii veziculoase a porcului:
a) principiile de baza și condițiile minime privind procedurile de diagnostic, metodele de prelevare de probe și criteriile pentru evaluarea rezultatelor testelor de laborator pentru un diagnostic corespunzător al bolii veziculoase a porcului. O importanța deosebită se acordă diagnosticului diferential cu febra aftoasa;
b) prevederile anexei nr. 2 la Norma sanitară veterinara privind măsurile generale pentru controlul unor boli ale animalelor și măsurile specifice referitoare la boala veziculoasa a porcului și, în special, pct. 4, 7 și 8 ale anexei menționate;
c) informații folosite în primul rând de autoritățile responsabile pentru controlul bolii veziculoase a porcului, accentul fiind pus pe principiile și aplicatiile testelor de laborator și pe evaluarea rezultatelor acestora și nu pe tehnici detaliate de laborator.
2. Conform prezentului manual, se înțelege prin:
a) porc seropozitiv - orice porc al cărui ser are un titru de anticorpi egal sau mai mare decât serul 4 de referința al bolii veziculoase a porcului la care se referă cap. X;
b) reactant unic - orice porc singur seropozitiv dintr-o exploatatie, care dezvolta un rezultat pozitiv la teste serologice pentru boala veziculoasa a porcului, dar care nu are antecedente de contact cu virusul bolii veziculoase a porcului și pentru care nu exista vreo dovada a răspândirii infectiei la porcii de contact. Un porc seropozitiv este confirmat ca reactant unic dacă sunt îndeplinite condițiile la care se referă cap. VIII lit. C;
c) porci de contact - porci care au contact direct sau au avut contact direct, în ultimele 28 de zile, cu unul sau mai mulți porci seropozitivi sau cu unul sau mai mulți porci suspecti de a fi infectati cu virusul bolii veziculoase a porcului. Porcii de contact pot fi cazati în aceeași boxa sau în boxe adiacente, dacă exista posibilitatea contactului porcilor între boxe.
Capitolul 3 — Proceduri generale pentru prelevare și transport de probe ↑ Cuprins
1. Orice persoană care intra sau iese din exploatații de porci, atunci când exista o suspiciune de boala veziculoasa a porcului, trebuie să respecte măsurile de igiena cele mai stricte, necesare pentru a reduce riscul contaminarii sau răspândirii cu virus.
2. Toți porcii de la care au fost prelevate probe trebuie să fie marcati individual în asa fel încât să poată fi identificati pentru eventuale reprelevari de probe. Se recomanda să fie înregistrată localizarea fiecărui porc din exploatatie de la care au fost prelevate probe, împreună cu marca sa individuală de identificare, în special dacă au fost prelevate probe de la porci suspecti.
3. Probele trebuie să fie trimise la laborator, însoțite de documentele corespunzătoare, care vor include detalii ale antecedentelor clinice ale porcilor de la care au fost prelevate probe și semnele clinice observate, dacă exista.
4. Atât timp cat orice afectiune veziculoasa la porci poate fi suspectata ca fiind febra aftoasa, trebuie să fie luate precautii speciale pentru impachetarea în condiții de siguranță maxima a probelor suspecte. Aceste precautii se referă la prevenirea spargerii sau fisurarii containerelor, precum și la riscul contaminarii, fiind, de asemenea, important să se asigure ca probele sa ajungă la laborator într-o stare satisfăcătoare. Dacă este pusă gheața în interiorul unui astfel de pachet, trebuie să fie prevenite scurgerile de apa. Nici un container ce conține probe suspecte de contaminare cu virusul bolii veziculoase a porcului nu trebuie să fie deschis decât când a ajuns în laborator.
5. Probele suspecte de contaminare cu virusul bolii veziculoase a porcului trebuie să fie analizate numai într-un laborator autorizat pentru a manipula virusul febrei aftoase în scopul diagnosticului, conform legislației naționale cu privire la controlul febrei aftoase, chiar dacă suspiciunea de febra aftoasa a fost deja eliminata.
6. Toate probele vor fi transportate la temperatura de 4°C, dacă durata transportului până la laboratorul de destinație este mai mica de 48 ore, sau la o temperatura maxima de -20°C, dacă durata transportului este mai mare.
7. Pentru probe destinate laboratorului de referința comunitar singura metoda de transport permisă este pe calea aerului via aeroportul din Londra (Heathrow) sau aeroportul Gatwick. Înainte de imbarcarea probelor laboratorul respectiv trebuie să fie informat prin fax (+44-1483 23 26 21) sau prin e-mail despre detaliile de zbor, data, timpul de sosire prevăzut și numărul zborului, pentru ca pachetul să poată fi localizat la sosire. Pachetul trebuie să fie adresat Institutului pentru Sănătate Animala, Laboratorul Pirbright, Laboratorul de referința comunitar pentru boala veziculoasa a porcului, Ash Road, Pirbright, Woking, Surrey GU24 ONF, Regatul Unit al Marii Britanii și Irlandei de Nord, UK.
Următoarele informații trebuie, de asemenea, să fie incluse pe eticheta: "Material patologic animal fără valoare comercială. Perisabil. Fragil. A fi ridicat din aeroport prin adresa. A nu fi deschis în afară laboratorului". Ridicarea autorizata a pachetului la aeroport se efectuează de personalul de la laboratorul de referința comunitar, în baza unei autorizații generale de import special emisă în acest scop de Ministerul Agriculturii, Alimentației și Pescuitului din Regatul Unit al Marii Britanii și Irlandei de Nord. Acesta este un acord permanent, o licenta separată care nu este solicitată pentru orice import. Transportul ca bagaj de mana al materialului vezicular suspect de către personal neautorizat, în Regatul Unit al Marii Britanii și Irlandei de Nord, precum și prin companiile de curierat este interzis.
8. Transportul probelor la laboratoarele naționale trebuie să fie conform instrucțiunilor stabilite de autoritatea veterinara centrala a României.
Capitolul 4 — Proceduri de prelevare a probelor într-o exploatatie cu porci suspecti clinic ↑ Cuprins
1. Când într-o exploatatie este suspectata prezenta virusului bolii veziculoase a porcului și au fost observate semne clinice de boala, trebuie să fie prelevate probe corespunzătoare de la grupuri reprezentative de porci care prezintă aceste semne, pentru a se confirma boala și a se efectua diagnosticul diferential față de febra aftoasa.
2. În aceste exploatații probele de referința pentru diagnostic sunt epiteliul și lichidul vezicular recoltat de la vezicule proaspăt rupte sau nerupte și prelevate de la porci care prezintă semne tipice de boala și la care pot fi detectate virusul bolii veziculoase a porcului, antigenele sau genomul acestora. Se recomanda să fie prelevate probe de la 5 sau 6 asemenea porci.
3. Chiar dacă sunt disponibile tesut epitelial proaspăt și lichid vezicular în cantitate suficienta (1 g sau mai mult), trebuie să fie prelevate și următoarele probe:
a) probe de sânge de la porci suspecti și porcii de contact, pentru testare serologica;
b) probe de fecale de la porci suspecti, de pe podeaua boxei acestora și de la boxele adiacente, pentru testare virusologica.
4. Probele trebuie să fie prelevate și transportate conform următoarelor proceduri:
a) pentru probe epiteliale și lichid vezicular:
1. trebuie să fie prelevat, dacă este posibil, cel puțin 1 g de tesut epitelial de la o vezicula rupta recent sau una nerupta. Se recomanda ca porcii să fie sedati înainte ca probele să fie prelevate, pentru a se evita vătămarea personalului și din motive de bunastare a porcilor;
2. dacă transportul probelor către laboratorul național este efectuat imediat - în mai puțin de 3 ore -, probele epiteliale pot fi transportate uscate și păstrate refrigerate. Dacă durata transportului depășește 3 ore, probele trebuie să fie puse într-un mediu de transport de volum mic, care consta din cantități egale de glicerol și 0,04 M fosfat-tampon sau alte substanțe-tampon echivalente, astfel încât pH-ul să fie menținut în limita optima pentru supravietuirea virusului febrei aftoase (pH de la 7,2 la 7,6). Mediul de transport trebuie să conțină antibiotice pentru activitate suplimentară antimicrobiana. Antibioticele corespunzătoare și concentratiile acestora per ml, definitive, sunt: 1.000 U.I. penicilina, 100 U.I. neomicina sulfat, 50 U.I. polimixina B sulfat, 100 U.I. micostatin;
3. dacă poate fi prelevat lichid vezicular de la o vezicula nerupta, acesta trebuie să fie păstrat nediluat, într-un container separat;
b) pentru probe de sânge: pot fi prelevate probe de sânge pentru teste serologice sau virusologice. În general, acestea sunt prelevate pentru detectarea anticorpilor și doar de la porci suspecti de a se fi insanatosit de infectia clinica sau subclinica, în timp ce epiteliul, lichidul vezicular și probele de fecale de la porci care prezintă semne clinice de boala sunt mult mai adecvate pentru detectarea virusului decât probele de sânge. Se recomanda ca probele de sânge integral să fie prelevate folosindu-se seringi vacuumate fără anticoagulant, iar acestea trebuie să fie transportate fără a fi deschise;
c) pentru probe de fecale:
1. probe de fecale recoltate de pe podeaua clădirilor suspectate de a conține sau de a fi conținut porci infectati cu virusul bolii veziculoase a porcului sau tampoane fecale și probe de fecale de la porci în viața suspecti trebuie să fie plasate în containere solide și rezistente la scurgeri;
2. containerele cu probe suspecte trebuie să fie dezinfectate pe dinafara, înainte de a fi transportate la laborator. Dezinfectantii corespunzatori sunt:
(i) hidroxidul de sodiu (dilutie 1:100);
(îi) formolul (dilutie 1:9 de soluție de formol care conține minimum 34% formaldehida); și
(iii) hipocloritul de sodiu (cu 2% clor disponibil).
Acești dezinfectanti trebuie să fie manevrati cu grija, deoarece sunt caustici.
Capitolul 5 — Proceduri de prelevare a probelor pentru supravegherea serologica a bolii veziculoase a porcului ↑ Cuprins
1. Pentru supravegherea exploatațiilor, atunci când nu exista nici o evidenta sau o suspiciune ca boala poate fi prezenta, se efectuează prin prelevare de probe serologice de rutina.
2. Pentru supravegherea la abator, la piața, la un centru de colectare sau în locuri similare, se efectuează prin prelevare de probe serologice de rutina.
3. Pentru supravegherea nediscriminatorie a porcilor primiți din state membre ale Uniunii Europene, probele de sânge pentru testarea serologica trebuie să fie prelevate de la porci din exploatatiile în care au fost introdusi, conform prevederilor legale în vigoare.
4. Pentru supravegherea exploatațiilor situate în cadrul zonelor de protecție sau de supraveghere care au fost stabilite ca urmare a confirmării focarelor de boala, conform pct. 7 și 8 din anexa nr. 2 la Norma sanitară veterinara privind măsurile generale pentru controlul unor boli ale animalelor și măsurile specifice referitoare la boala veziculoasa a porcului, sau pentru supravegherea exploatațiilor la care se referă art. 9 din Norma sanitară veterinara privind măsurile generale pentru controlul unor boli ale animalelor și măsurile specifice referitoare la boala veziculoasa a porcului, probele de sânge trebuie să fie prelevate de la porci, pentru testare serologica, conform cu următoarea schema:
a) în cazul exploatațiilor pentru reproducție trebuie să fie efectuată o procedură aleatorie de prelevare de probe, în asa fel încât să se detecteze o prevalenta de 5% de seroconversie cu 95% fidelitate;
b) în cazul exploatațiilor care conțin numai porci pentru ingrasare, procedura de prelevare de probe trebuie să asigure ca numărul total de probe prelevate să fie cel puțin egal cu numărul necesar pentru a se detecta o prevalenta de 5% de seroconversie cu 95% fidelitate. În orice caz probele trebuie să fie prelevate, pe cat este posibil, de la cat mai multe boxe selectate aleatoriu;
c) în cazul exploatațiilor mixte, de creștere și reproducție, trebuie să fie prelevate probe de la fiecare grup de porci care este cazat în clădiri separate, în asa fel încât să se detecteze o prevalenta de 5% de seroconversie cu 95% fidelitate.
Capitolul 6 — Acțiuni ulterioare și proceduri de reprelevare de probe în cazul detectarii de porci seropozitivi ↑ Cuprins
1. Când într-o exploatatie este detectat un singur porc seropozitiv în urma supravegherii la care se referă cap. V pct. 1 sau 4, autoritatea veterinara locală trebuie:
a) să aplice măsurile la care se referă art. 4 din Norma sanitară veterinara privind măsurile generale pentru controlul unor boli ale animalelor și măsurile specifice referitoare la boala veziculoasa a porcului;
b) să efectueze un control în exploatatie conform prevederilor cap. II pct. 1;
c) sa preleveze probe de sânge pentru testarea serologica de la:
- porcii de contact care sunt cazati în aceeași boxa sau în boxe adiacente cu porcul suspect. Trebuie să fie prelevate probe de la acești porci în asa fel încât să se detecteze o prevalenta de 50% de seroconversie cu 95% fidelitate pentru fiecare boxa.
2. Autoritatea veterinara centrala a României poate decide sa ridice măsurile la care se referă pct. 1 lit. a) al prezentului capitol, dacă:
a) ancheta epizootologica efectuată conform prevederilor art. 8 din Norma sanitară veterinara privind măsurile generale pentru controlul unor boli ale animalelor și măsurile specifice referitoare la boala veziculoasa a porcului arata ca boala veziculoasa a porcului nu a fost introdusă în exploatatie;
b) nici un semn clinic de boala veziculoasa a porcului nu a fost detectat în exploatatie; și
c) exploatatia nu este situata într-o zona de supraveghere sau de restrictie, stabilită ca urmare a unui focar de boala confirmat, nu este supusă altor restrictii aplicate cu privire la un focar de boala confirmat și cu condiția ca:
- nici un porc din exploatatie sa nu facă obiectul comerțului României cu statele membre ale Uniunii Europene; și
- porci de la exploatatia respectiva să fie livrați doar la un abator pentru a fi taiati imediat sau la alta exploatatie din care nici un porc nu face obiectul comerțului României cu statele membre ale Uniunii Europene, până când rezultatele controalelor ulterioare și ale testelor serologice arata ca boala veziculoasa a porcului poate fi eliminata definitiv.
3. Dacă controalele și testele serologice efectuate conform pct. 1 lit. b) și c) ale prezentului capitol:
a) au rezultate negative sau numai un porc pozitiv este în prealabil confirmat pozitiv (reactant unic), boala veziculoasa a porcului poate fi infirmata. Măsurile la care se referă pct. 1 lit. a) vor fi ridicate, cu excepția cazului când exploatatia se afla într-o zona de protecție sau de supraveghere stabilită în jurul unui focar de boala, unde măsurile de eradicare a bolii trebuie să fie în vigoare, conform pct. 7 sau 8 din anexa nr. 2 la Norma sanitară veterinara privind măsurile generale pentru controlul unor boli ale animalelor și măsurile specifice referitoare la boala veziculoasa a porcului;
b) arata faptul ca este prezent mai mult de un porc seropozitiv în exploatatie, boala veziculoasa a porcului trebuie să fie confirmată sau, dacă condițiile stabilite la pct. 4 din anexa nr. 2 la Norma sanitară veterinara privind măsurile generale pentru controlul unor boli ale animalelor și măsurile specifice referitoare la boala veziculoasa a porcului nu sunt îndeplinite pentru a confirma prezenta acestei boli, trebuie să fie prelevate din exploatatie ulterior probe conform procedurilor de prelevare de probe la care se referă pct. 4 al prezentului capitol.
4. În cazul în care este detectat mai mult de un porc seropozitiv într-o exploatatie, ca urmare a prelevarii de probe și a testelor serologice la care se referă cap. V pct. 1 și 3 sau pct. 2 al prezentei anexe, iar condițiile stabilite la pct. 4 din anexa nr. 2 la Norma sanitară veterinara privind măsurile generale pentru controlul unor boli ale animalelor și măsurile specifice referitoare la boala veziculoasa a porcului nu sunt îndeplinite, pentru a se confirma boala veziculoasa a porcului autoritatea veterinara centrala a României trebuie să dispună următoarele:
a) aplicarea sau continuarea aplicării prevederilor art. 4 din Norma sanitară veterinara privind măsurile generale pentru controlul unor boli ale animalelor și măsurile specifice referitoare la boala veziculoasa a porcului;
b) efectuarea unui control în acea exploatatie, conform prevederilor cap. II pct. 1;
c) prelevarea ulterior de probe de sânge pentru testarea serologica de la porci seropozitivi și de la porcii de contact, conform pct. 1 lit. c) al prezentului capitol;
d) prelevarea probelor de sânge pentru testarea serologica de la porcii din alte clădiri ale exploatatiei, conform procedurii cap. V pct. 2;
e) prelevarea unui număr suficient de probe de fecale pentru testele virusologice:
(i) de la porci seropozitivi;
(îi) de pe podeaua boxelor care conțin porci seropozitivi și a boxelor adiacente;
(iii) din boxe selectate aleatoriu din alte clădiri ale exploatatiei - probele de fecale prelevate trebuie să fie examinate cat mai curând posibil, conform prevederilor pct. (i) și (îi).
Dacă aceste probe sunt negative, dar rezultatele testelor serologice creează suspiciunea ca virusul bolii veziculoase a porcului poate fi răspândit la celelalte clădiri, trebuie prelevate probe de fecale conform prevederilor pct. (iii), pentru a fi examinate; dacă în urma acestor controale și teste ulterioare condițiile stabilite la pct. 4 din anexa nr. 2 la Norma sanitară veterinara privind măsurile generale pentru controlul unor boli ale animalelor și măsurile specifice referitoare la boala veziculoasa a porcului nu sunt îndeplinite, pentru a se confirma prezenta bolii veziculoase a porcului, porcii seropozitivi vor fi ucisi sau taiati, conform prevederilor pct. 4 lit. d) din anexa nr. 2 la Norma sanitară veterinara privind măsurile generale pentru controlul unor boli ale animalelor și măsurile specifice referitoare la boala veziculoasa a porcului. Dacă ulterior au fost gasiti mai mulți porci seropozitivi, pe lângă ceilalți deja gasiti seropozitivi ca urmare a prelevarii de probe anticipate, prevederile și procedurile stabilite la lit. a), b), c), d) și e) ale prezentului punct vor fi aplicate ulterior mutatis mutandis.
5. Fără a aduce atingere măsurilor prevăzute la art. 9 din Norma sanitară veterinara privind măsurile generale pentru controlul unor boli ale animalelor și măsurile specifice referitoare la boala veziculoasa a porcului, când unul sau mai mulți porci sunt detectati pozitiv, ca urmare a activității de supraveghere la care se referă cap. V pct. 2 sau 3, autoritatea veterinara centrala a României va dispune:
a) efectuarea controalelor ulterioare corespunzătoare, când este necesar, care includ și prelevarea de probe, pentru a se confirma sau a se infirma boala veziculoasa a porcului în locul unde acești porci au fost detectati, luând în considerare situația epizootologica locală;
b) aplicarea în exploatatia de origine a acestor porci a măsurilor prevăzute la art. 4 din Norma sanitară veterinara privind măsurile generale pentru controlul unor boli ale animalelor și măsurile specifice referitoare la boala veziculoasa a porcului;
c) efectuarea unui control în exploatatia de origine a acestor porci, conform prevederilor cap. II pct. 1; și
d) prelevarea probelor de sânge de la porcii din exploatatia de origine pentru testarea serologica a porcilor seropozitivi, conform prevederilor cap. V pct. 2.
6. Autoritatea veterinara centrala a României poate decide sa ridice măsurile prevăzute la pct. 5 lit. b) al prezentului capitol, dacă:
a) ancheta epizootologica, efectuată conform prevederilor art. 4 și 8 din Norma sanitară veterinara privind măsurile generale pentru controlul unor boli ale animalelor și măsurile specifice referitoare la boala veziculoasa a porcului, arata ca boala veziculoasa a porcului nu a fost introdusă în exploatatie;
b) nici un semn clinic de boala veziculoasa a porcului nu a fost detectat în exploatatie;
c) exploatatia nu este situata într-o zona de supraveghere sau de restrictie stabilită ca urmare a confirmării unui focar de boala și nu este supusă altor restrictii aplicate pentru a se confirma un focar de boala, cu condiția ca:
(i) nici un porc din exploatatie sa nu facă obiectul comerțului României cu statele membre ale Uniunii Europene; și
(îi) porcii din exploatatie să fie destinați doar tăierii imediate, la un abator sau la alta exploatatie de la care nici un porc nu face obiectul comerțului României cu statele membre ale Uniunii Europene, până când rezultatele controalelor ulterioare și ale testelor serologice efectuate în locul unde au fost detectati porci seropozitivi și în exploatatia de origine arata ca boala veziculoasa a porcului poate fi cu certitudine infirmata.
Capitolul 7 — Principii și aplicații ale testelor virusologice și evaluarea rezultatelor lor ↑ Cuprins
A. Detectarea antigenului viral
1. Un test sandwich ELISA indirect înlocuiește testul de fixare a complementului, ca metoda selectata pentru detectarea antigenului viral al bolii veziculoase a porcului. Testul este același ca cel utilizat pentru diagnosticul febrei aftoase. Testele pentru cele doua boli trebuie să fie efectuate în același timp, cu excepția cazului în care febra aftoasa a fost deja infirmata. Se recomanda în special probe de epiteliu sau de lichid din leziunile veziculoase, în care atât virusul bolii veziculoase a porcului, cat și cel al febrei aftoase pot fi prezente la titruri înalte la porcii cu infectie acuta și care sunt detectati în câteva ore*1).
*1) Rezultatele pozitive ELISA sunt asociate cu prezenta a cel puțin 10 5 TCID50 - doze infectioase de cultura de tesut - de virus în probe.
Randuri duplicat din plăcile ELISA multigodeu sunt acoperite cu antiser de iepure contra virusului bolii veziculoase a porcului și pentru fiecare dintre cele 7 serotipuri ale virusului febrei aftoase. Acestea sunt seruri de blocare. Suspensii ale probei de testat se adauga la fiecare godeu al celor două randuri. Controale pozitive sunt de asemenea incluse. Ser de detectie omolog de cobai este adăugat în godeurile din randurile respective, în etapa următoare ori apoi, de ser de iepure anticobai conjugat cu o enzima, cum ar fi peroxidaza de hrean. Se realizează spalarea intensiva între fiecare etapa, pentru a se îndepărta reagentii nelegati.
O reactie pozitiva este indicată dacă exista o reactie de culoare la adăugarea cromogenului și a substratului. Reactiile intens pozitive pot fi evidentiate cu ochiul liber, dar rezultate pot să fie citite, de asemenea, spectrofotometric, caz în care o citire a absorbantei de 0,1 deasupra limitei de fond indica o reactie pozitiva.
2. Pot fi folosite sisteme alternative bazate pe anticorpi monoclonali, sisteme care selecteaza anticorpi monoclonali precum anticorpii de blocare și anticorpii peroxidazo-conjugati monoclonali ca anticorpi de detectie, pentru detectarea antigenului bolii veziculoase a porcului și pentru diagnosticul diferential de febra aftoasa în probele de epiteliu, lichid vezicular sau cultura de tesut infectat.
3. Poate fi folosit un sistem bazat pe anticorpi monoclonali pentru a se studia variatia antigenica dintre tulpinile virusului bolii veziculoase a porcului. Antigenele virale crescute în tesutul-cultura sunt blocate de un antiser hiperimun de iepure contra bolii veziculoase a porcului, adsorbit de faza solida. Secvente corespunzătoare de anticorpi monoclonali reactioneaza și legarea anticorpilor monoclonali la tulpinile sălbatice este comparata cu legarea anticorpilor monoclonali la tulpinile parentale. O legătură similară indica prezenta epitopilor, impartiti între tulpinile parentale și cele sălbatice.
B. Izolarea și creșterea virusului
1. Ca rutina, suspensii filtrate de probe de epiteliu, lichid vezicular sau fecale suspecte de a conține virusul bolii veziculoase a porcului trebuie să fie inoculate pe culturi de celule sensibile. Dacă cantitatea și calitatea probelor prelevate din leziuni și supuse examinării sunt insuficiente pentru examinarea imediata prin ELISA, este necesară creșterea de virus în cultura de tesut pentru a amplifica antigenul viral.
2. Pentru a izola și a crește virusul, suspensia epiteliala filtrata este inoculata pe culturi monostrat de celule IB-RS-2. Trebuie să fie utilizate doua dilutii de suspensie epiteliala, una de concentrație mare (1/500) și una de concentrație mica (1/10) pentru a evita interferenta cu virusul crescut pe interferon, a cărui eliberare va interfera cu virusul bolii veziculoase a porcului. Pentru izolarea virusului sunt adăugate numai antibiotice, în vederea menținerii mediului. Pentru diagnosticul diferential față de febra aftoasa trebuie, de asemenea, să fie inoculate celule tiroidiene primare de bovine sau celule renale de pui de hamster (BHK-21).
3. Dacă se dezvolta un efect citopatic, fluidul supernatant trebuie să fie prelevat din culturile pozitive, atunci când efectul este complet, și utilizat în testul ELISA pentru identificarea virusului. Culturile negative trebuie să fie inoculate pe culturi de tesut proaspăt de 48 sau 72 de ore, iar acest pasaj orb trebuie examinat după 72 de ore. În absenta efectului citopatic, după un pasaj orb ulterior proba poate fi declarata negativa pentru prezenta virusului viu.
4. Suspensii de probe de fecale pot fi procesate ca în descrierea de la pct. 1. Deoarece în general exista mai puțin virus în fecale decât în epiteliu, este esențial ca în absenta unui efect citopatic la primele doua pasaje să fie inclus un al treilea pasaj orb.
5. Inocularea simultană a unei linii celulare porcine și a unuia dintre sistemele de cultura de tesut menționat mai sus - de preferat celule tiroidiene bovine primare - este un ghid util pentru a determina dacă probele veziculare conțin virusul bolii veziculoase a porcului sau virusul febrei aftoase care, ca și în primul sistem, se va dezvolta numai în celule de origine porcina. Totuși culturile de virus al febrei aftoase, cu o istorie îndelungată de transmitere între porci, pot, de asemenea, să se dezvolte, de preferinta, în sistemele de culturi celulare de origine porcina.
C. Reactia de polimerizare în lant pentru depistarea genomului (PCR)
1. Metode de recunoaștere a acidului nucleic pot fi utilizate pentru a detecta genomul viral al bolii veziculoase a porcului în materialul clinic și care folosește tehnica PCR pentru a stabili legăturile dintre tulpinile de virus al bolii veziculoase a porcului, prin determinarea secventei de nucleotide a unei părți de genom. Tehnici care folosesc PCR au fost perfectate pentru a se îmbunătăți sensibilitatea diagnosticului. Au fost descrise proceduri de PCR-RT ușor diferite, folosind primeri care corespund unor regiuni intens conservate din genele 1C și 1D ale genomului viral.
2. Tehnica PCR este rapida - rezultatele sunt de obicei disponibile în 24 de ore - și se detecteaza toate genotipurile de virus al bolii veziculoase a porcului, fiind suficient de sensibila pentru a se utiliza la prelevarea probelor de la cazurile suspecte clinic de boala.
3. Atunci când este suspectata infectia subclinica sau atunci când probele sunt colectate după dispariția bolii clinice ori când este necesară procesarea probelor de fecale, tehnicile PCR-RT perfectionate, asemănătoare PCR-RT secventiale, PCR-imun, PCR-ELISA și metode mai elaborate de extracție a ARN, care produc un sistem de detectare cel puțin la fel de sensibil, dar considerabil mult mai rapid decât pasajul multiplu pe cultura de tesut.
4. Prin secventarea a aproximativ 200 de nucleotide din cadrul genei 1D care codifica proteina structurală majoră VP1 este posibila gruparea tulpinilor virusului bolii veziculoase a porcului, conform omologiei lor de secventa, precum și a tulpinilor înrudite epidemiologic și care provoacă boli în regiuni diferite sau la perioade diferite.
D. Evaluarea rezultatelor testelor virusologice
1. Detectarea de antigene sau de genom al virusului bolii veziculoase a porcului prin metodele ELISA sau PCR are aceeași valoare de diagnostic ca și izolarea virusului.
2. Totuși izolarea virusului trebuie să fie considerată ca test de referința și trebuie să fie utilizata ca test de confirmare, dacă este necesar, în special dacă un rezultat pozitiv ELISA sau PCR nu este asociat cu:
a) detectarea de semne clinice ale bolii;
b) detectarea de porci seropozitivi; sau
c) o legătură epizootologica directa cu un focar confirmat.
Capitolul 8 — Principii și aplicații ale testelor serologice și evaluarea rezultatelor acestora ↑ Cuprins
A. Test de neutralizare a virusului (VN)
1. Microtestul cantitativ de virus neutralizare (VN) pentru detectarea anticorpilor indusi de virusul bolii veziculoase a porcului este efectuat pe celule IB-RS-2 sau pe un sistem de celule echivalent, în plăci de microtitrare cu fundul lat din categoria cu cultura de tesut.
2. Virusul este crescut în monostraturi de celule IB-RS-2 și depozitat fie la -20°C după adăugarea de glycerol 50%, fie la -70°C fără glycerol. Serurile sunt inactivate înaintea testarii la 56°C timp de 30 de minute.
1. Testul ELISA pentru detectarea anticorpilor este un test competitiv bazat pe anticorpi monoclonali. Dacă proba de ser conține anticorpi ai virusului bolii veziculoase a porcului, legătură unor anticorpi monoclonali selectați, conjugati cu peroxidaza, cu antigenul virusului bolii veziculoase a porcului va fi inhibata. În acest test ELISA antigenul viral al bolii veziculoase a porcului este blocat în faza solida, folosindu-se anticorpi monoclonali, apoi probele de ser sunt incubate în dilutie corespunzătoare, urmată de adăugarea anticorpului monoclonal conjugat cu peroxidaza. Ulterior inhibitia legăturii anticorpului monoclonal cu antigenul bolii veziculoase a porcului este masurata prin intermediul unui substrat și al unui cromogen.
2. Un test ELISA indirect de blocare, care folosește anticorpi monoclonali izotipi specifici pentru a se detecta IgG sau IgM specifică porcului contra virusului bolii veziculoase a porcului, este util pentru evaluarea timpului de la infectia porcilor sau de la contaminarea spațiilor infectate. În cazul acestui test ELISA izotipul specific antigenului viral este blocat în faza solida, folosindu-se un anticorp de captare a antigenului. Dacă proba de ser conține anticorpi pentru virusul bolii veziculoase a porcului, aceștia sunt detectati folosindu-se o IgG antiporc sau o IgM antiporc monoclonal conjugat cu peroxidaza. Ulterior aceasta legătură este masurata prin intermediul unui substrat și al unui cromogen.
Testul ELISA izotip specific poate fi util, de asemenea, pentru deosebirea reactantului unic de adevaratii porci pozitivi, asa cum prevede lit. C.
C. Aplicarea testelor serologice și evaluarea rezultatelor
1. Testul de VN și testul ELISA sunt teste serologice recomandate. Cap. X enumera serurile de referința care sunt disponibile la laboratorul de referința comunitar, pentru a standardiza testele serologice efectuate în Comunitatea Europeană. Testul de VN trebuie să fie considerat ca test de referința, dar are dezavantajul ca se finalizează în 2 sau 3 zile și necesita facilități pentru culturi celulare. Testul ELISA este mult mai rapid și poate fi mult mai ușor standardizat. Testul ELISA de competiție cu anticorpi monoclonali este cel mai fiabil. Testul ELISA descris până în prezent, utilizând anticorpi ai bolii veziculoase a porcului, este recomandat ca test de screening pentru un număr mare de probe. Totuși testul de VN trebuie să fie utilizat ca test de confirmare, dacă este necesar, în special după prima detectare de probe pozitive într-o exploatatie. Porcii pozitivi la testul ELISA, dar negativi la testul de VN, pot fi omisi.
2. Prezenta unui reactant unic*2) poate fi suspectata atunci când este detectat un singur porc seropozitiv și când sunt îndeplinite următoarele criterii:
a) nu exista semne clinice de boala în exploatatie;
b) nu exista un istoric relevant al bolii clinice în exploatatie;
c) nu exista antecedente de contact cu un focar de boala.
3. Un porc este confirmat drept reactant unic atunci când:
a) după testare nu sunt identificati alți porci seropozitivi;
b) prelevarea de probe efectuată la porcii de contact după prima detectare a reactantului unic nu indica seroconversie;
c) titrul de anticorpi pentru o prelevare de probe repetată rămâne constant sau deviaza.
4. Totuși următoarele criterii și principii suplimentare trebuie, de asemenea, să fie luate în considerare pentru confirmarea unui reactant unic:
a) reactantii unici apar cu o prevalenta de aproximativ 1 per 1.000 de porci;
b) serurile de la reactantii unici au, în general, următorul profil: titrul anticorpilor scăzut la testul de VN, linia de granita pozitiva la testul ELISA de competiție pe bază de anticorpi monoclonali, nici o IgM și nici o IgG la testul ELISA izotip specific pentru boala veziculoasa a porcului*3).
Capitolul 9 — Semne clinice și particularități ale bolii veziculoase a porcului ↑ Cuprins
1. Boala veziculoasa a porcului este o boala contagioasa a porcilor, produsă de un enterovirus din familia Picornaviridae care poate evolua sub forma veziculoasa subclinica, ușoară sau severă, ce depinde de tulpina de virus implicata, de calea și doza infectanta, precum și de condițiile de creștere în care au fost ținuți porcii. Factorii de stres suplimentari, precum transportul, aglomerarea cu alți porci și temperaturile extreme, pot, de asemenea, predispune la dezvoltarea semnelor clinice.
2. Boala se caracterizează printr-o febra ușoară și apariția de vezicule pe bureletul coronarian, pe protuberantele calcaielor, pe pielea membrelor și mai puțin frecvent pe rat, buze, limba și mameloane. Rata morbiditatii poate fi până la 100%, iar mortalitatea este foarte scăzută sau nulă.
3. Infectia se poate dezvolta sub o formă inaparenta sau ușoară care prezintă doar o afectare tranzitorie în starea generală a porcilor și care conduce la dezvoltarea de anticorpi ce neutralizeaza virusul în câteva zile*4). Din cauza naturii subclinice sau ușoare a bolii, aceasta este deseori suspectata prima, ca urmare a testelor serologice pentru supravegherea bolii sau pentru certificarea exportului. Focarele europene recente de boala veziculoasa a porcului au fost caracterizate prin semne clinice mai puțin severe sau chiar fără semne clinice, diagnosticul fiind frecvent dependent de testele serologice. Totuși semnele clinice ale bolii veziculoase a porcului nu se pot deosebi de cele ale febrei aftoase. Orice forma veziculara trebuie să fie tratata inițial ca suspecta de febra aftoasa, iar diagnosticul diferential trebuie să fie efectuat cat mai curând posibil.
*2) O proporție mica de reactant unic poate fi detectata prin orice test serologic curent utilizat pentru boala veziculoasa a porcului. Factorii responsabili pentru reactantii unici sunt necunoscuți.
Reactivitate serologica incrucisata cu virusul bolii veziculoase a porcului poate aparea datorită infectarii cu un alt picornavirus încă neidentificat sau poate fi datorat altor factori nespecifici prezenți în ser.
*3) IgG specifică singura sau atât IgG, cat și IgM sunt de obicei detectate în probe de ser de la porcii infectati cu virusul bolii veziculoase a porcului, întrucât serul de la reactantii unici conține în general numai IgM. IgG nu va fi detectata în probele de ser de la porcii infectati cu virusul bolii veziculoase a porcului într-o perioadă de până la 10 sau 14 zile. Totuși IgG specifică va fi detectata în a doua proba de sânge. Porcii infectati recent nu pot fi deosebiți în mod sigur de reactantii unici înainte ca răspunsul imun al acestora să se modifice de la producerea de IgM la cea de IgG. A se vedea, de asemenea, și nota de subsol*4).
4. Perioada de incubație a bolii veziculoase a porcului la porcii individuali este, de obicei, între 2 și 7 zile, după care urmează febra pasagera de până la 41°C, dar semnele clinice pot deveni evidente în exploatatie după o perioadă mai lungă. Veziculele se dezvolta apoi pe bureletul coronarian, în special la jonctiunea cu onglonul. Acestea pot afecta întregul burelet coronarian și provoacă pierderea copitei. Mult mai rar veziculele pot, de asemenea, să apară pe rat, în special pe suprafața dorsala, pe buze, pe limba și pe mameloane, iar eroziuni de dimensiuni mici pot fi observate pe genunchi. Porcii afectați pot schiopata și pot refuza hrana. Porcii mai tineri sunt mult mai sever afectați, deși mortalitatea datorată bolii veziculoase a porcului este foarte rara, în contrast cu febra aftoasa, la efectivul tânăr.
5. Au fost raportate semne nervoase, dar acestea sunt neobisnuite. Avortul nu este o caracteristica tipica a bolii veziculoase a porcului. Insuficienta cardiaca datorată miocarditei multifocale poate fi o caracteristica a febrei aftoase și a encefalomiocarditei, în special la purceii tineri, dar nu apare în boala veziculoasa a porcului.
6. Vindecarea este de obicei completa în 2 sau 3 săptămâni, singura evidenta a infectiei fiind o linie orizontala, întunecată pe copita, acolo unde creșterea onglonului a fost întreruptă temporar.
7. Porcii afectați pot excreta virusul prin orificiile nazale și pe gura și prin fecale, cu 48 de ore înainte de apariția semnelor clinice. Cea mai mare cantitate de virus este eliminata în primele 7 zile după infectie, iar excretia de virus prin orificiile nazale și pe gura se oprește, în mod normal, după doua săptămâni. Virusul poate fi izolat din fecale până la 20 de zile după infectie, deși a fost raportată prezenta sa până la 3 luni. Acesta poate persista pentru o perioadă considerabila în tesutul necrotic asociat cu vezicule rupte și în fecale.