ORDIN nr. 109 din 17 noiembrie 2004

NORMA SANITARĂ VETERINARA ȘI PENTRU SIGURANTA ALIMENTELOR

ce stabilește cerințe pentru determinarea nivelurilor de dioxina și a compusilor policlordifenili (PCB) asemanatori dioxinei din furaje

la norma sanitară veterinara și pentru siguranța alimentelor

METODE DE PRELEVARE DE PROBE PENTRU CONTROLUL OFICIAL AL NIVELURILOR

DE DIOXINE (PCDD/PCDF) ȘI DETERMINAREA COMPUSILOR POLICLORDIFENILI PCBs

ASEMANATORI DIOXINEI DIN ANUMITE FURAJE

1. Scop și aplicabilitate

Probele destinate controlului oficial al nivelurilor conținutului de dioxine (PCDD/PCDF), precum și determinarea conținutului de compuși policlordifenili asemanatori dioxinei din furaje, trebuie să fie prelevate în conformitate cu prevederile "Normei sanitare veterinare și pentru siguranța alimentelor ce stabilește metode naționale de prelevare de probe pentru controlul oficial al furajelor". Probele globale astfel obținute trebuie să fie considerate ca reprezentative pentru loturile sau subloturile din care acestea sunt prelevate. Conformitatea cu nivelurile maxime stabilite de "Norma sanitară veterinara privind limitele maxime admise pentru unele substanțe și produse în furaje", aprobată prin Ordinul ministrului agriculturii, alimentației și pădurilor nr. 294/11.07.2002, publicat în Monitorul Oficial al României, Partea I, nr. 731/7.10.2002 trebuie să fie stabilită pe baza nivelurilor determinate în probele de laborator.

2. Conformitatea lotului sau a sublotului cu specificațiile

Laboratorul de control trebuie să analizeze proba de laborator și contraproba, prin analiza dubla, în cazul în care rezultatul obținut la prima analiza este diferit cu cel puțin 20%, fie inferior, fie superior față de nivelul maxim determinat inițial iar apoi se calculează media rezultatelor. Lotul este acceptat dacă rezultatul primei analize este cu mai puțin de 20% sub nivelul maxim stabilit inițial sau atunci când este necesară analiza dubla, dacă media este în conformitate cu nivelul maxim respectiv, stabilit de "Norma sanitară veterinara privind limitele maxime admise pentru unele substanțe și produse în furaje".

1) Tabel al WHO - TEFs pentru evaluarea riscului public bazat pe concluziile intalnirii Organizației Mondiale a Sănătății de la Stockholm, Suedia, din 15-18 iunie 1997 (Van den Berg și col., (1998) Factori de Echivalenta Toxica (TEFs) pentru PCBs, PCDDs, PCDFs pentru oameni, pentru animale și pentru vietuitoare. Perspective de Sănătate a Mediului, 106(12), 775).

Abrevieri utilizate: T = tetra; Pe = penta; Hx = hexa; Hp = hepta; O = octo; CDD = clorodibenzodioxina: CDF = clorodibenzofuran; CB = clorodifenil.

la norma sanitară veterinara și pentru siguranța alimentelor

PREPARAREA PROBELOR ȘI CERINȚE PENTRU METODELE DE ANALIZA

UTILIZATE PENTRU CONTROLUL OFICIAL AL NIVELURILOR DE DIOXINE (PCDD/PCDF)

ȘI DETERMINAREA COMPUSILOR POLICLORDIFENILI (PCBs) ASEMANATORI

DIOXINEI DIN ANUMITE FURAJE

1. Obiective și domeniu de aplicare

Aceste cerințe trebuie să fie aplicate atunci când materiile furajere și furajele sunt analizate pentru determinarea nivelurilor de dioxine (dibenzo-p-dioxine policlorurate (PCDD) și dibenzofurani policlorurati (PCDF) și pentru determinarea compusilor policlorodifenili (PCBs) asemanatori dioxinei.

Monitorizarea pentru prezenta dioxinelor în furaje poate fi efectuată printr-o strategie ce implica o metoda de screening, cu scopul de a selecta acele probe cu niveluri de dioxine și compuși policlorodifenili asemanatori dioxinei (PCBs) ce au valori diferite cu 30-40%, fie inferioare, fie superioare nivelului de interes. Concentrația de dioxine din acele probe cu niveluri semnificative trebuie să fie determinata/confirmată printr-o metoda de confirmare.

Metodele de screening sunt metode ce sunt utilizate pentru a detecta prezenta compusilor policlorodifenili (PCBs) asemanatori dioxinei la nivelul de interes. Aceste metode au o capacitate mare de examinare a probelor și sunt utilizate pentru a detecta un număr mare de probe ca fiind potențial pozitive. Acestea sunt special desemnate pentru a se evita rezultate fals negative.

Metodele de confirmare sunt metode ce furnizează informații complete sau complementare ce permit ca dioxinele și compusii policlordifenili asemanatori dioxinelor să fie clar identificati și cuantificati la nivelul de interes.

2. Date de referința

Deoarece probele de mediu și probele biologice (ce includ probe de materii furajere/furaje), conțin, în general, amestecuri complexe de diferiți congeneri de dioxina, a fost elaborat conceptul de Factori de Echivalenta Toxica (TEFs), pentru a se facilita evaluarea riscului. Acești TEFs au fost stabiliți pentru a se exprima concentratiile de amestecuri de PCCDs și de substituenti PCDFs 2,3,7,8 și mai recent, a unor substituenti non-orto și mono-orto clor de PCB ce poseda în echivalenti toxici, activitate asemănătoare dioxinei, (TEQs) de 2,3,7,8,-TCDD (vezi anexa nr. 1, nota de subsol 1).

Concentratiile substanțelor individuale într-o proba data sunt multiplicate prin valoarea TEF respectiva a acestora și apoi insumate, pentru a se obține concentrația totală a compusilor asemanatori dioxinei, exprimată ca TEQs.

Conceptul de "limita superioară" necesita utilizarea limitei de cuantificare pentru participarea la TEQ a fiecărui congener necuantificat.

Conceptul de "limita inferioară" necesita utilizarea valorii zero pentru participarea la TEQ a fiecărui congener necuantificat.

Conceptul de "limita medie" necesita utilizarea jumătății limitei de cuantificare, calculand contribuția la TEQ a fiecărui congener necuantificat.

3. Cerințe de asigurare a calității ce trebuie să fie respectate pentru prepararea probei

În plus față de cele prezentate anterior, probele trebuie să fie conforme cu următoarele cerințe:

(a) probele trebuie să fie depozitate și transportate în containere din sticlă, aluminiu, polipropilena sau polietilena. Trebuie să fie indepartate urmele resturilor de hârtie de pe containerul cu proba. Sticlaria trebuie să fie spalata cu solventi în prealabil controlati în vederea detectarii dioxinelor.

(b) să se realizeze o analiza martor prin efectuarea întregii proceduri analitice, omitandu-se doar proba.

(c) greutatea probei utilizate pentru extracție trebuie să fie suficienta, pentru a se întruni cerințele în ceea ce privește sensitivitatea.

4. Cerințe pentru laboratoare

(a) Laboratoarele trebuie să demonstreze performanta metodei în zona nivelului de interes (ex. 0,5x, 1x, și 2x nivelul de interes), cu un coeficient acceptabil de variatie pentru analiza repetată. Pentru detalii ale criteriilor de acceptare vezi punctul 5.

(b) Limita cuantificării pentru o metoda de confirmare trebuie să fie într-un interval de aproximativ o cincime din nivelul de interes (limita), pentru a fi siguri ca, în fapt, coeficienți de variatie acceptabili sunt intalniti în zona nivelului de interes (limita).

(c) Trebuie să fie efectuate controale oarbe regulate ale martorului și ale experimentelor susținute sau analiza pe probe de control (preferabil, dacă este disponibil, pe material de referința certificat), ca măsuri interne de control al calității.

(d) Cea mai buna cale pentru a se demonstra competența în efectuarea analizelor specifice este participarea cu succes la studii inter-laboratoare ce evalueaza experienta laboratorului. Totuși, participarea cu succes la studiile inter-laboratoare (de ex. pentru probe de sol sau probe de apa uzata ce prezintă niveluri de contaminare inferioare) este necesară pentru a se dovedi competența, de asemenea, în domeniul probelor de furaje și de alimente. De aceea, este obligatorie participarea continua la studiile inter-laboratoare pentru determinarea dioxinelor și a compusilor policlorodifenili asemanatori dioxinei cu privire la matricele relevante de alimente și furaje.

Laboratoarele trebuie să fie acreditate de un organism recunoscut în conformitate cu ghidul ISO 58, pentru a se asigura ca acestea aplica proceduri analitice de asigurare a calității. Laboratoarele trebuie să fie acreditate urmând standardul ISO/IEC/17025:1999 standard.

5. Cerințe ce trebuie să fie îndeplinite de procedura analitica pentru dioxine și compuși policlorodifenili asemanatori dioxinelor

Cerințe fundamentale pentru acceptarea procedurilor analitice:

(a) Sensitivitate înaltă și limite reduse de detectie. Pentru PCDDs și PCDFs, cantitățile detectabile trebuie să fie de ordinul picogramelor TEQ (10-12 g) din cauza toxicitatii extreme a unor compuși. Este cunoscut faptul ca, de regula, compusii policlorodifenili asemanatori dioxinelor apar la niveluri mai mari decât PCDDs și PCDFs. Pentru cei mai mulți congeneri ai compusilor policlorodifenili asemanatori dioxinelor sensitivitatea este deja de ordinul nanogramelor (10-9 g). Totuși, pentru măsurarea mai multor congeneri toxici ai compusilor policlorodifenili asemanatori dioxinelor (în special congeneri non-orto substituiti), trebuie să fie atinsa aceeași sensitivitate ca și pentru PCDDs și PCDFs.

(b) Selectivitate înaltă (specificitate). Este necesară o distincție a compusilor PCDDs, PCDFs și a compusilor policlorodifenili asemanatori dioxinelor, dintr-o multitudine de alți compuși coextrasi și posibili compusii de interferenta prezenți la concentratii de până la câteva ordine de mărime mai mari decât cele ale substanțelor analizate luate în considerație. Pentru metodele de gaz - cromatografie/spectrometrie de masa (GC-MS) este necesară o diferentiere între diferiți congeneri, precum și între compusii toxici (de ex. 17 PCCDs 2,3,7,8 substituit și PCDFs și compuși policlorodifenili asemanatori dioxinei) ori alți congeneri. Biotestele trebuie să permită determinarea selectiva a valorilor TEQ, ca suma a PCDDs, PCDFs și a compusilor policlorodifenili asemanatori dioxinei.

(c) Înaltă acuratete (fidelitate și precizie). Determinarea trebuie să furnizeze o estimare valida a concentratiei reale a unei probe. O înaltă acuratete (acuratetea masuratorii: fidelitatea gradului de concordanta între rezultatul unei măsurători cu o valoare reală sau atribuită a masuratorii) este necesară, pentru a se evita respingerea rezultatului analizei unei probe, ca urmare a unui deficit de fiabilitate a TEQ estimat. Acuratetea este exprimată ca fidelitate (diferența între valoarea medie masurata pentru o substanța de analizat dintr-un material certificat și valoarea certificată a acestuia, exprimată ca procentaj din aceasta valoare) și precizie (precizia este, în mod obișnuit, calculată ca o deviatie standard ce include repetabilitatea și reproductibilitatea și indica gradul de concordanta între rezultatele obținute prin aplicarea repetată a procedurii experimentale în condiții determinate). Metodele de screening pot cuprinde bioteste și metode GC-MS. Ca metode de confirmare sunt: metodele de gaz - cromatografie de înaltă rezoluție și/sau spectrofotometrie de masa de înaltă rezoluție (HRGC/HRMS). Trebuie să fie respectate următoarele criterii privind valoarea totală a TEQ.

6. Cerințe specifice pentru metode de GC/MS ce trebuie să fie respectate în scop de confirmare sau de screening

(a) Adăugarea de standarde interne de substituent PCDD/F de clor-2,3,7,8 marcate C^13 (și de standarde interne ale compusilor policlorodifenili (PCB) asemanatori dioxinei, marcati C^13 dacă trebuie să fie determinati compuși policlorodifenili (PCB) asemanatori dioxinei) trebuie să fie efectuată la debutul metodei de analiza (ex. anterior extractiei), pentru a se valida procedura analitica. Trebuie să fie adăugat cel puțin un congener pentru fiecare din grupele clorurate izomere de la tetra la octo de PCDD/F (și cel puțin un congener pentru fiecare din grupele izomere de compuși policlorodifenili asemanatori dioxinei, dacă aceștia trebuie să fie determinati) și alternativ cel puțin un congener pentru fiecare funcție de înregistrare a ionului selecționat prin spectrometrie de masa (utilizat pentru monitorizarea PCDD/F și a compusilor policlorodifenili asemanatori dioxinei). Exista, cu siguranța, o preferinta clara, în cazul metodelor de confirmare, de utilizare a tuturor standardelor interne de substituenti PCDD/F 2,3,7,8 marcate C^13 și a tuturor standardelor interne ale compusilor policlorodifenili asemanatori dioxinei marcate C13 (dacă trebuie să fie determinati compusii policlorodifenili asemanatori dioxinei).

Trebuie să fie determinati, de asemenea, factorii de răspuns relativ pentru acei congeneri pentru care nu este adăugat nici un analog marcat C^13, prin utilizarea soluțiilor de etalonare corespunzătoare.

(b) Pentru alimente de origine vegetala și alimente de origine animala ce conțin mai puțin de 10% grasime, adăugarea de standarde interne este obligatorie anterior extractiei. Pentru alimente de origine vegetala ce conțin mai mult de 10% grasime, standardele pot fi adăugate, fiecare, înaintea extractiei sau după extractia grasimii. Trebuie să fie efectuată o validare corespunzătoare a eficientei extractiei, în funcție de stadiul la care standardele interne sunt introduse, dacă rezultatele sunt raportate pe baza produsului sau grasimii.

(c) Anterior metodei de analiza GC/MS, trebuie să fie adăugat unul sau doua standarde de recuperare (substitutie).

(d) Este necesar controlul recuperării. Pentru metodele de confirmare, recuperarile de standarde interne individuale trebuie să fie într-o gama de valori cuprinsă între 60% și 120%. Pentru congeneri individuali, în special pentru unele dibenzodioxine și dibenzofurani hepta și octo clorurate, sunt acceptabile recuperari inferioare sau superioare, cu condiția ca, în fapt, participarea acestora la valoarea TEQ sa nu depășească 10% din totalul valorii TEQ (bazat doar pe PCDD/F). Pentru metode de screening, recuperarea trebuie să fie situata în limitele de 30%-140%.

Separarea dioxinelor de compusii clorurati interferenti, ca de exemplu compusii policlorodifenili asemanatori dioxinei și difenileterii clorurati, trebuie să fie efectuată prin tehnici cromatografice corespunzătoare (de preferinta pe o coloana de florisil, alumina și/sau cărbune).

(e) Separarea izomerilor prin cromatografie în faza gazoasa trebuie să fie suficienta (mai puțin de 25% de la pic la pic între 1,2,3,4,7,8-XxCDF și 1,2,3,6,7,8-XxCDF)

(f) Determinarea trebuie să fie efectuată în conformitate cu Metoda EPA 1613 revizuire B: "Dioxine și furani tetra-octo clorurati prin metoda de dilutie a izotopilor, HRGC/HRMS sau alta metoda cu criterii echivalente de performanță".

Diferența între limita superioară și limita inferioară nu trebuie să depășească 20% pentru alimente cu o contaminare în dioxine de aproximativ 1 pg OMS-TEQ/g grasime (bazată numai pe PCCD/PCDF). Pentru alimente cu un conținut scăzut de grasime, trebuie să se aplice aceleași cerințe ca și pentru niveluri de contaminare de aproximativ 1 pg OMS-TEQ/g produs. Pentru niveluri de contaminare inferioare (de ex. 0,50 pg OMS-TEQ/g produs) diferența între nivelul superior și nivelul inferior poate fi într-o gama de valori cuprinsă între 20-40%.

7. Metode de analiza de screening

7.1. Introducere

Pot fi efectuate diferite abordari analitice, utilizând o metoda de screening: o abordare pura pentru screening și o abordare cantitativă.

Abordare pentru screening

Răspunsul probelor este comparat cu cel al unei probe de referința, la nivelul de interes (limita). Probele cu un răspuns inferior celui de referința sunt declarate negative, cele cu un răspuns superior sunt presupuse pozitive. Cerințe:

(a) În fiecare serie de testări trebuie să fie incluse un martor și o proba de referința ce trebuie să fie extrasa și testata în același timp și în condiții identice. Răspunsul probei de referința trebuie să fie crescut în comparatie cu al unui martor.

(b) Trebuie să fie incluse probele de referința suplimentare, (într-o gama de concentratii de 0,5x și 2x nivelul de interes (limita), pentru a se demonstra performanta proprie a testului, în vederea controlului nivelului considerat.

(c) Atunci când se testeaza alte matrice, trebuie să fie demonstrata aplicabilitatea probei(lor) de referința, de preferinta prin includerea probelor menționate la metoda HRGC/HRMS, pentru a conține un nivel TEQ aproape de cel al probei de referința sau al unui martor îmbogățit la acest nivel.

(d) Din moment ce nici un standard intern nu poate fi utilizat în bioteste, testele cu privire la repetabilitate sunt foarte importante, pentru a se obține informații privind deviatia standard în cadrul unei serii de teste. Coeficientul de variatie trebuie să fie inferior valorii de 30%.

(e) Pentru bioteste, trebuie să fie definiți compusii ținta, interferentele posibile și nivelurile maxime tolerabile ale martorului.

Abordare cantitativă

Abordarea cantitativă necesita serii de dilutii ale standardului, curatare și măsurare dubla sau tripla, precum și controale de recuperare și ale martorului. Rezultatul poate fi exprimat ca TEQ, prin acesta se presupune ca, în fapt, compusii responsabili de semnal sunt conformi cu principiul TEQ. Aceasta poate fi efectuată prin utilizarea TCDD (sau a unui amestec standard de dioxina/furan), pentru a se elabora o curba de etalonare în vederea calculării valorii nivelului TEQ din extract și în consecința din proba. Prin urmare, aceasta este corectată pentru nivelul TEQ calculat pentru o proba martor (pentru a se tine cont de impuritatile din solventi și substantele chimice utilizate) și pentru recuperare (calculată pornind de la nivelul TEQ într-o proba de control de calitate apropiată de nivelul de interes (limita). Este esențial a se nota ca o parte a recuperării pierderii aparente poate fi datorată efectelor matricei și/sau diferențelor între valorile TEF în bioteste și valorile TEF oficiale, stabilite de OMS.

7.2. Cerințe pentru metode de analiza utilizate pentru screening

(a) Metodele de analiza GC/MS și biotestele pot fi utilizate pentru screening. Cerințele stabilite la punctul 6 trebuie să fie utilizate pentru metodele GC/MS. La punctul 7.3 sunt stabilite cerințe specifice pentru bioteste celulare, iar la punctul 7.4 cerințe pentru bioteste realizate cu ajutorul kiturilor.

(b) Trebuie să fie furnizate informații privind numărul de rezultate fals pozitive și fals negative ale unui set mare de probe, peste sau sub nivelul maxim sau nivelul de lucru, în comparatie cu valoarea TEQ determinata printr-o metoda analitica de confirmare. Ratele de probe fals negative actuale trebuie să fie sub 1%. Rata de probe fals pozitive trebuie să fie suficient de mica, pentru a face o metoda avantajoasă, ca instrument de screening.

(c) Rezultatele pozitive trebuie să fie întotdeauna confirmate printr-o metoda de analiza (HRGC/HRMS). În plus, probe dintr-o gama larga de TEQ trebuie să fie confirmate prin HRGC/HRMS (aproximativ 2%-10% din probele negative). Trebuie să fie furnizate informații privind corespondenta între biotest și rezultatele HRGC/HRMS.

7.3. Cerințe specifice pentru bioteste celulare

(a) Când se executa un biotest, fiecare testare necesita o serie de concentratii de referința ale TCDD sau ale unui amestec de dioxina/furan (curba de răspuns cu un R2 > 0,95 pentru o doza completa). Totuși, pentru scopuri de screening poate fi utilizata o curba de nivel scăzut extinsă, pentru analizarea de probe de analiza cu nivel scăzut.

(b) Pentru rezultatul biotestului, trebuie să fie utilizata o concentrație TCDD de referința (aproximativ de 3x limita de cuantificare) într-un interval de timp constant. O alternativa poate fi răspunsul relativ al unei probe de referința în comparatie cu curba de etalonare TCDD, deoarece răspunsul celulelor poate depinde de mai mulți factori.

(c) Graficele de control al calității (QC) pentru fiecare tip de material de referința trebuie să fie înregistrate și verificate, pentru a se garanta ca rezultatul este în conformitate cu liniile directoare stabilite.

(d) Realizarea dilutiei probei utilizate trebuie să fie situata în cadrul porțiunii liniare a curbei de răspuns, în special pentru calcularile cantitative. Probele ce sunt situate deasupra acestei porțiuni liniare a curbei de răspuns, trebuie să fie diluate și retestate. Totuși, se recomanda să fie testate periodic, cel puțin trei sau mai multe dilutii.

(e) Procentul deviatiei standard nu trebuie să depășească 15% într-o tripla determinare pentru fiecare dilutie a probei și sa nu depășească 30% pentru trei experimente independente.

(f) Limita de detectie poate fi stabilită ca de trei ori valoarea deviatiei standard a solventului martor sau a răspunsului de fond. Alta abordare este de a aplica un răspuns ce este superior celui de fond (factor de inductie de 5x martorul solventului), calculat pe curba de etalonare a zilei. Limita de cuantificare poate fi stabilită ca o valoare de la 5x la 6x deviatia standard a martorului solventului sau a răspunsului de fond, sau să se aplice un răspuns ce este clar superior răspunsului de fond (factor de inductie de 10x martorul solventului), calculat pe curba de etalonare a zilei.

7.4. Cerințe specifice pentru bioteste pe bază de kituri

(a) Pentru prepararea probei și pentru analize trebuie să fie urmate instrucțiunile fabricantului.

(b) Kiturile pentru analize nu trebuie să fie utilizate după data expirării.

(c) Nu trebuie să fie utilizate materiale sau componenți destinați pentru alte kituri.

(d) Kiturile pentru analize trebuie să fie păstrate în cadrul unui interval specificat de temperatura de depozitare și utilizate la temperatura de lucru specificată.

(e) Limita de detectie pentru imuno-dozari este determinata cu o valoare de 3x deviatia standard bazată pe o serie de 10 analize repetate ale martorului și care trebuie separate prin valoarea pantei dreptei ecuatiei de regresie liniara.

(f) Trebuie să fie utilizate standarde de referința pentru teste de laborator, pentru a se asigura ca răspunsul, în ceea ce privește standardul, se situeaza într-un interval acceptabil de valori.

8. Raportarea rezultatului

În măsura în care procedura analitica utilizata permite, rezultatele analitice trebuie să conțină niveluri individuale ale congenerilor PCDD/F și PCB și trebuie să fie raportate ca limita inferioară, limita superioară și limita medie, pentru a se include un maxim de informații în raportarea rezultatelor și astfel să se permită interpretarea rezultatelor în conformitate cu cerințele specifice.

Raportarea trebuie, de asemenea, sa includă conținutul în lipide al probei, precum și metoda utilizata pentru extractia lipidelor.

Trebuie să fie disponibile informații despre recuperarile standardelor interne individuale, în cazul recuperarilor situate în afară intervalului menționat la punctul 6, în cazul în care nivelul maxim este depășit precum și în alte cazuri, la cerere.

---------